反相液相色譜法（RPLC）是迄今為止在質(zhì)譜分析之前分離肽的首選方法。這種偏愛主要是因?yàn)樵摲椒ň哂辛己玫姆蛛x度，可再現(xiàn)的結(jié)果，并且很重要的是與電噴霧電離兼容。

實(shí)際上，在現(xiàn)代質(zhì)譜儀中，RPLC系統(tǒng)都可以輕松連接到電離源，這樣，當(dāng)肽從色譜柱上洗脫下來時(shí)，它們可以自動(dòng)轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜分析中。

在RPLC中，根據(jù)肽的疏水性在稱為色譜柱的細(xì)管中分離肽。管柱用多孔二氧化硅珠均勻地填充，使得顆粒之間的未占用空間盡可能小。

每個(gè)珠子包含附著的疏水鏈。對(duì)于肽分離，通常使用長烷基鏈，例如C8或C18，盡管也有其他選擇。柱的填充通常表示為固定相。

RPLC中使用了兩種類型的稱為流動(dòng)相的溶劑。按照慣例，這些溶劑表示為A和B。溶劑A是指一種水性緩沖液，通常由水和0.1％的酸組成。溶劑B通常由很大dà 例的有機(jī)溶劑（如乙腈和0.1％的酸）組成。

其RPLC設(shè)備都包括一種以jīng確比例泵送和混合兩種溶劑的機(jī)制。

在分離過程中，將目標(biāo)肽混合物溶解在溶劑A中，并注入到色譜柱中。當(dāng)它們穿過硅膠珠時(shí)，具有不同特性的肽會(huì)以不同的強(qiáng)度與烷基鏈結(jié)合。

為了將它們從色譜柱中釋放出來，逐漸將越來越多的溶劑B與緩沖液A混合，然后泵送通過色譜柱（如下圖）。每種肽均以特定濃度的溶劑B釋放，因此代表肽種類的suǒ有單個(gè)分子大約在同一時(shí)間洗脫。因此，如果測量色譜柱出口處的信號(hào)，則將觀察到每種不同肽種類的峰。

液相色譜原理。將與流動(dòng)相混合的肽注入色譜柱（圖A）。隨著越來越多的溶劑B混入，肽段按疏水性順序從色譜柱中釋放出來（圖B和C）。列末的信號(hào)可以在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測量，并顯示為色譜圖（圖D）肽需要經(jīng)過色譜柱的時(shí)間很短，稱為保留時(shí)間。

人們經(jīng)常使用術(shù)語保留時(shí)間來指代與每種肽的洗脫峰的頂點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的時(shí)間（圖D）。這個(gè)時(shí)間點(diǎn)將與肽降低珠子和溶劑之間的表面電勢的能力成比例，我們通常將這種特性稱為肽的疏水性。通常，肽越疏水，保留時(shí)間越長。由于溶劑B的比例決定了肽的洗脫，因此用于添加溶劑B的方案是其RPLC實(shí)驗(yàn)的重要方面。當(dāng)前，常用的方法是基于線性梯度，其中溶劑B的增加遵循線性函數(shù)。

大多數(shù)肽在溶劑B的百分比達(dá)到40％之前就已洗脫出來，因此梯度通常從2％升至40％B。在運(yùn)行結(jié)束時(shí)B百分比的高增加可確保將所有剩余化合物從溶劑中沖走。

RPLC的一大優(yōu)勢是其良好的多功能性。通過改變各種參數(shù)，例如色譜柱尺寸，固定相和流動(dòng)相的組成，溫度或梯度斜率，該方法可適用于分離各種化合物。

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