在多肽固相合成中，我們通常使用一些顯色試劑對(duì)肽樹(shù)脂進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)保證能夠快速定性檢測(cè)氨基酸是否偶聯(lián)完全、Fmoc保護(hù)基團(tuán)是否脫除成功。由于具有顯色反應(yīng)迅速，顯色明顯，檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，茚三酮顯為最常用的顯色試劑。溴酚藍(lán)，四氯苯醌等也是比較常用的顯色試劑，下面看一下各種顯色試劑的配制，使用方法以及注意事項(xiàng)。

1.  茚三酮顯色試劑

可以清楚地顯示游離胺的存在，由Kaiser等人開(kāi)發(fā)因此也叫做Kaiser檢測(cè)。該測(cè)試通常在氨基酸偶聯(lián)過(guò)程之前和之后進(jìn)行，目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)試劑。

1.1   配制方法

試劑A: 80g苯酚溶于20ml乙醇，為方便配制，苯酚可以提前加熱融化后配制。

試劑B: 2ml的0.001M的KCN水溶液加入98ml重蒸后的吡啶中。重蒸吡啶過(guò)程中可以加入少量茚三酮以除去吡啶中能使茚三酮變色的物質(zhì)。

試劑C：5g茚三酮溶于95ml乙醇中。

1.2   檢測(cè)方法

在杜氏玻璃小管中加入少量樹(shù)脂，一般使用鋪滿(mǎn)試管底部一層的樹(shù)脂，之后加入上述配制好的A、B、C三種試劑各兩滴，在100-120℃下加熱3-5min。如果樹(shù)脂顯藍(lán)色說(shuō)明存在未保護(hù)的氨基，脫Fmoc完成。如果樹(shù)脂無(wú)色說(shuō)明偶聯(lián)反應(yīng)完全。

1.3   使用說(shuō)明

Kaiser測(cè)試雖然是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法，但他也有自己的局限性，例如不能檢測(cè)二級(jí)胺（如脯氨酸），也不能檢測(cè)無(wú)α-H的氨基酸的氨基（如二氨基異丁酸，α-甲基亮氨酸等α-雙取代氨基酸）。其機(jī)理如下圖

茚三酮首先脫水與氨基縮合得到亞胺，隨后亞胺脫羧后異構(gòu)化為另一種形式的亞胺，水解后釋放出出一分子伯胺和一分子醛。伯胺進(jìn)一步與茚三酮發(fā)生縮合得到二聚的亞胺衍生物從而顯色。

2.  四氯苯醌顯色試劑

四氯苯醌顯色試劑主要用來(lái)檢測(cè)二級(jí)胺（如脯氨酸），也是一種比較常用的顯色試劑。由于脫Fmoc試劑一般都是二級(jí)胺（如哌啶，嗎啉，二甲胺），因此也可以用四氯苯醌顯色試劑來(lái)檢測(cè)肽樹(shù)脂從而判斷使用二級(jí)胺脫Fmoc后殘留的二級(jí)胺是否被洗滌干凈。

2.1   配制方法

試劑A: 2g四氯苯醌溶于98ml DMF中

試劑B: 2ml乙醛溶于98ml DMF中

2.2   檢測(cè)方法

在杜氏玻璃小管中加入少量樹(shù)脂，一般使用鋪滿(mǎn)試管底部一層的樹(shù)脂，之后加入上述配制好的A、B兩種試劑各兩滴，室溫下放置5-10min，若存在未保護(hù)的氨基一般樹(shù)脂顯藍(lán)綠色。

3.  溴酚藍(lán)顯色試劑

顯色快速而敏感，但由于顯色過(guò)于敏感，偶聯(lián)結(jié)束后顯色常常顯示偽陽(yáng)性。

3.1   配制方法

1g溴酚藍(lán)溶于99ml DMA中。

3.2   檢測(cè)方法

在杜氏玻璃小管中加入少量樹(shù)脂，一般使用鋪滿(mǎn)試管底部一層的樹(shù)脂，之后加入上述配制好的溴酚藍(lán)溶液，立即顯色。如果樹(shù)脂顯藍(lán)色說(shuō)明存在未保護(hù)的氨基。

4.  TNBS顯色試劑

4.1   配制方法

試劑A: 5ml DIPEA溶于95ml DMF中

試劑B: 1g TNBS 溶于99ml水中

4.2   檢測(cè)方法

在杜氏玻璃小管中加入少量樹(shù)脂，一般使用鋪滿(mǎn)試管底部一層的樹(shù)脂，之后加入上述配制好的A、B兩種試劑各兩滴，室溫下放置10min，如果樹(shù)脂顯黃色或紅色說(shuō)明存在未保護(hù)的氨基。

寫(xiě)到最后:

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