分析色譜比較常見的吸附劑顆粒直徑為5μm，制備色譜經(jīng)常使用的吸附劑顆粒直徑更加大。特別是加樣量超出樣品存儲量時（柱過載），柱效與分析色譜相比影響比較小。當柱過載時，大顆粒直徑填充柱同小顆粒直徑填充柱分離蛋白和多肽的效果差不多。所以，制備色譜較常用10μm及以上顆粒直徑的吸附劑。粒徑分布通常都比較寬。與0.5μm或更窄的粒徑分布范圍不一樣的是，制備色譜的粒徑范疇更廣，比如10~15μm。制備色譜柱成本較低，所以一般會選擇選用大粒子。

1、柱內(nèi)徑

因為樣品存儲量比較低，純化流程不怎么使用內(nèi)徑低于2mm的小孔柱。大批量多肽時，使用10mm和22mm內(nèi)徑的柱子。1mg蛋白或多肽的純化也可以采用10mm柱子，5mg純化可采用22mm柱子。大批量蛋白或多肽的純化采用50mm、100mm或內(nèi)徑更大的大內(nèi)徑柱子。

2、柱長

與分析柱比起來，制備柱通常較為短。因為在制備色譜法中，柱的總體積比柱長更為重要，尤其是蛋白的分離。

內(nèi)徑60cm、柱長12-15cm（“圓餅狀”柱）的色譜柱已運用在蛋白的大規(guī)模純化中。因為在制備色譜法中，柱通常過載，且收益的重要程度比不上總產(chǎn)量、純度及通量重要，所以按照其實用價值而不是經(jīng)濟效益改進柱尺寸。

3、流動相組成

與分析色譜法相同，使用10~22mm內(nèi)徑柱的較小規(guī)模純化較常用乙腈-TFA體系。大規(guī)模的純化一般使用乙醇等溶液取代乙腈，選用乙酸代替TFA。雖然選用這種溶劑作流動相會降低分辨率，但是它們更加適合大規(guī)模的應用，且分辨率的下降與柱過載既有的分辨率損害一致

4、蛋白變性

普遍認為反相色譜可以讓蛋白變性，所以洗脫得出來的蛋白并非天然蛋白，且很有可能沒有生物活性。即使反相HPLC的操作要求會讓蛋白變性，但洗脫后依然可以獲得天然、具備生物活性的蛋白。

基于二硫鍵的作用，蛋白維持球形構造，且只出現(xiàn)局部去折疊，所以從反相柱洗脫出來的蛋白往往可通過在恰當?shù)闹卣郫B緩沖液中處理，進而復原其天然結構而恢復至tian然狀態(tài)。

很多案例顯示采用反相HPLC純化之后的蛋白仍保持天然三級結構和生物活性。胰蛋白酶的反相純化，當中活性得到了保留，且緊接著用來蛋白的胰蛋白酶酶切。

寫到最后:

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