N-末端測(cè)定

1、二硝基氟苯法(FDNB, DNFB)：Sanger在1945年提出了這種方法，這是他的重要貢獻(xiàn)之一。用有機(jī)溶劑提取DNP-氨基酸后，可通過(guò)層析位置進(jìn)行鑒別。Sanger用這種方法測(cè)定了胰島素的N末端分別為甘氨酸和苯丙氨酸。

2、氰酸鹽法：1963年，Smyth和Stank提出了一種測(cè)定N末端的新方法。步驟如下:由于乙內(nèi)酰脲氨基酸不帶電荷，可以通過(guò)離子交換層析法將其與游離氨基酸分離，分離得到的乙內(nèi)酰脲氨基酸可被鹽酸水解生成游離氨基酸，通過(guò)識(shí)別這個(gè)氨基酸，我們可以知道N-末端是什么類型的氨基酸。

3、二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年，Hartley等人報(bào)道了一種測(cè)定N-端的靈敏方法，使用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯，簡(jiǎn)稱丹磺酰氯。它與游離氨基末端相互作用，方法與Sanger的DNFB方法相似，產(chǎn)物為磺酰胺衍生物。丹磺酰鏈酸具有強(qiáng)烈的黃色熒光。該方法靈敏度高(比FDNB法高100倍，樣品體積小于1毫微克分子)，丹磺酰氨基酸穩(wěn)定性高(高于DNP氨基酸水解穩(wěn)定性)，可通過(guò)紙電泳或聚酰胺膜層析進(jìn)行鑒別。

C-末端分析

1、肼解法：這是測(cè)定C-末端最常用的方法。多肽溶于無(wú)水肼中，在100℃下反應(yīng)。結(jié)果，羧基末端的氨基酸以游離氨基酸的形式被釋放出來(lái)，而肽鏈的其余部分和肼形成了氨基酸肼。這樣就可以通過(guò)抽提或離子交換層析分離羧基末端氨基酸進(jìn)行分析。如果羧基末端氨基酸側(cè)鏈含有天冬酰胺、谷氨酰胺等酰胺，則在肼解過(guò)程中不能產(chǎn)生游離羧基末端氨基酸。此外，在肼解過(guò)程中應(yīng)注意避免任何少量的水解，以免將釋放的氨基酸與最終分析混淆。

2、羧肽酶水解：羧肽酶能專一性水解羧基末端氨基酸。根據(jù)酶解的專一性可分為羧肽酶A、B、C三種，在用羧肽酶確定末端時(shí)，需要提前進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，以選擇合適的酶濃度和反應(yīng)時(shí)間，使釋放的氨基酸主要為C末端氨基酸。

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