1.線性肽的合成將PACPEGPS樹脂0.5g（替代度0.2mmol/g）用N，N-二甲基甲酰胺（DMF）浸泡30min進行活化.。采用對稱酸酐法將已經(jīng)活化的樹脂進行第一個氨基酸的連接.稱取待連接的氨基酸195mg，加入1.5mL二氯甲烷（DCM）和3滴DMF使之溶解，加入1mol/L二環(huán)己基碳化二亞胺（DCC）/N甲基吡咯烷酮（NMP）275mL，磁力攪拌，室溫下反應(yīng)15min，反應(yīng)完畢，過濾除去沉淀，蒸發(fā)掉過濾液中的溶劑，得到對稱酐.將得到的對稱酐溶于最少量的DMF中（保證最大濃度），加入到活化的樹脂中，搖動1min，然后加入0.1mol/L，4二甲氨基吡啶（DMAP）/DMF460μL，搖動反應(yīng)90min，吹去反應(yīng)液，用10mLDMF洗滌3次，吹干。

其余7個氨基酸的連接采用原位活化法，將連接有第一個氨基酸的樹脂放入反應(yīng)瓶中，加入300mL/L哌啶/DMF溶液50mL反應(yīng)15min，以脫去FMOC保護基團。取2.0mmol保護氨基酸，用1mol/LDIEA/DMF5mL溶解，加入4.0mmolTBTU和4.0mmolHOBT（DMF為溶劑），預(yù)反應(yīng)15～20min，然后和氨基酸樹脂一起反應(yīng)2h，吹去反應(yīng)液，50mLDMF沖洗3次，吹干。

將已合成好連接有全部氨基酸序列的樹脂放入裂解容器中。按照TFA∶水＝95∶5(V/V)切割試劑，使用時按25mL切割試劑與1g樹脂反應(yīng)的比例進行切割，反應(yīng)時間為2h.。將反應(yīng)液快速倒入150mL乙醚中，收集沉淀，所用乙醚需預(yù)先放在低溫冰箱中冷卻。將沉淀重新加蒸餾水溶解，再轉(zhuǎn)移到凍干機中凍干。

2.線性肽的脫鹽用5mL固相萃取小柱，先用蒸餾水、500mL/L甲醇、蒸餾水各15mL進行平衡，每次上樣0.5mL（1～2g/L），用蒸餾水15mL進行脫鹽，按甲醇∶水＝85∶15(V/V)的比例配置洗脫液，15mL洗脫液進行樣品的洗脫，洗脫液凍干后得樣品。

3.在分支狀多聚賴氨酸支架上用順序法合成八分支肽將賴氨酸作為第一個氨基酸按1.2.1的方法進行連接.。每次均脫保護15min以上，偶聯(lián)60min連接3次，得到八分支多聚賴氨酸骨架，將此支架上的賴氨酸作為合成肽的C端第一個氨基酸，依次進行八肽的連接。

4.在分支狀多聚賴氨酸支架上用片段合成法制備八分支肽將分支狀多聚賴氨酸做為第一個氨基酸，把已合成并純化好的線性肽作為待連接的氨基酸按照片斷合成法連接到該支架上.。將5.5mg（0.007mmol）線形肽和5mg（0.0007mmol）線形多聚賴氨酸按照10∶1的比例混合，加PBS緩沖液（pH7.4）5～10mL溶解；加少量20g/L戊二醛進行連接，每10min加入2mL,加3～4次，中間要搖晃或者采用磁力攪拌，反應(yīng)完畢將溶液過G25凝膠柱子，收集，凍干，得到3mg左右連接好的復(fù)合物。

5.八分支肽的脫鹽用G25凝膠15g，溶脹后裝柱，裝好后的柱子先用蒸餾水50mL進行平衡，每次上樣3～5mL，蒸餾水進行洗脫，用核酸蛋白檢測儀檢測220nm處紫外吸收，按峰收集組分，將第一個峰的組分收集，凍干，成為脫鹽的樣品，凍干后備用。

6.HPLC純化多肽用半制備HPLC，洗脫系統(tǒng)為：①A液：50mL/L乙腈/H2O溶液；②B液：950mL/L乙腈/H2O溶液.。手動進樣，每次1mL，流速4mL/min，線性梯度，45min內(nèi).B液從50mL/L升到500mL/L，然后5min內(nèi)升到950mL/L，B液做最后洗脫.220nm處檢測紫外吸收，按峰收集組分，用于質(zhì)譜檢測.。將分子質(zhì)量檢測正確的組分收集，凍干，成為需要的純品，備用。

7.質(zhì)譜檢驗多肽采用激光解析質(zhì)譜鑒定多肽，數(shù)據(jù)分析軟件為G2025ASoftwareA.02.01，方法嚴(yán)格按照操作手冊進行，檢測合成多肽的分子質(zhì)量。

寫到最后：

杭州固拓生物科技有限公司定制多肽合成業(yè)務(wù):藥物肽、臨床肽、訂書肽、淀粉肽、醛肽、環(huán)肽、二硫鍵搭橋多肽、穿膜肽、各種抗菌肽、美容肽、磷酸化肽、PEG肽、偶聯(lián)BSA和KLH抗原肽、各類酸修飾多肽、各種胺類化合物修飾多肽(苯胺、異戊胺、二乙胺)、各類榮光標(biāo)記(FITC、FAM系列、DOTA、TAMRA系列、Cy系列)同位素肽等。

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